Il dipinto raffigura l'episodio saliente della storia dell'eroina ebrea Giuditta - a cui è dedicato un intero libro della Bibbia cristiana a lei intitolato - ambientata durante il regno del re babilonese Nabucodonosor, che affida al generale assiro Oloferne la campagna d'Occidente contro il popolo di Israele.  Nel corso della guerra la città di Betulia è posta sotto assedio per ben trentasei giorni e la sua popolazione ridotta allo stremo delle forze per fame e per sete. Qui entra in scena il piano della ricca e bella vedova Giuditta che, con l'aiuto di uno stratagemma, si reca nel campo nemico, finge di cedere alle seduzioni di Oloferne e, durante un banchetto, lo fa ubriacare e lo uccide, colpendolo due volte al collo con la sua spada.
La tela di Veronese, databile al 1580 circa, raffigura con estremo realismo il momento in cui Giuditta consegna le macabre spoglie alla sua ancella Abra, pronta a riceverle nella bisaccia dei viveri. La testa del generale, successivamente esposta dalle mura della città assediata, induce gli Assiri a ritirarsi.
L'opera, fra le più celebri della collezione di Palazzo Rosso, apparteneva in origine al conte Cuccina di Venezia, importante committente del Veronese; passò poi al pittore e mercante franco-fiammingo Nicolas Régnier che, fra i molti collezionisti interessati a comprarla, la vendette a Giuseppe Maria Durazzo nel 1670, da cui pervenne per via ereditaria ai Brignole - Sale.
L'artista utilizza il tema di Giuditta, peraltro affrontato almeno in un'altra occasione negli anni ottanta del XVI secolo, per realizzare un dipinto giocato su sapienti contrasti cromatici e umanistici dati dalla contrapposizione degli incarnati scuri del corpo decapitato - reso con un particolare realismo anatomico - e di quello della serva nei confronti, rispettivamente, dei bianchi lenzuoli e della carnagione d'avorio di Giuditta, illuminata con grande effetto da una luce che spiove da destra.